作者：勵(lì)合
2020-04-02
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一、 實(shí)驗(yàn)流程
1. 蛋白質(zhì)提取
1.1 每個(gè)蛋白樣品組織加入對(duì)應(yīng)標(biāo)記的1.5 ml離心管中，約100mg每個(gè)樣品。在液氮中研磨完全至粉末狀。加入200 μl的RIPA裂解液 （康為世紀(jì)強(qiáng)裂解液CW2333S；裂解液中加入PMSF，終濃度1 mM；加入Phosphatase Inhibitor Cocktail （康為試劑，CW2383），終濃度1X）。
1.2 樣品在冰上靜置30 min。15 min顛倒混勻一次。
1.3 樣品離心，12,000 g 4 ℃離心20 min。
1.4 吸取上清溶液即為蛋白樣品。（盡量避免吸取底層組織沉淀。）樣品顏色為略微淺[敏感詞]。
2. 蛋白質(zhì)定量 （康為世紀(jì) BCA Protein Assay kit）
2.1 稀釋BSA標(biāo)準(zhǔn)品
| 管號(hào) |
稀釋液用量 （μl） |
BSA標(biāo)準(zhǔn)品用量 (μl) |
BSA終濃度 (μg/μl) |
| 1 | 0 | 20 | 2 |
| 2 | 25 | 25 | 1 |
| 3 | 25 | 25(從管2中取) | 0.5 |
| 4 | 25 | 25(從管3中取) | 0.5 |
| 5 | 25 | 25(從管4中取) | 0.125 |
| 6 | 25 | 25(從管5中取) | 0.0625 |
| 7 | 25 | 0 | 0 |
采用梯度稀釋方式，從高濃度逐級(jí)稀釋。每個(gè)樣品從前一個(gè)樣品中吸取對(duì)應(yīng)的體積。樣品6混合均勻后吸出25 μl棄用，故所有樣品均為25 μl。
2.2 準(zhǔn)備樣品 每個(gè)樣品加入2.5 μl加入22.5 μl lysis buffer，混合均勻備用。每個(gè)樣品做兩個(gè)重復(fù)。
2.3 配置BCA工作液 BCA-A液與BCA-B液按1:50體積比配成工作液，充分混勻。
2.4 定量檢測(cè) 樣品及標(biāo)準(zhǔn)品中每管加入200 μl工作液，混合均勻。然后放到37℃水浴鍋中反應(yīng)30 min。反應(yīng)結(jié)束后立即冷卻終止反應(yīng)。在3-5 min內(nèi)檢測(cè)每個(gè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品562 nm吸光值。
2.5 根據(jù)BSA標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算每個(gè)樣品中的蛋白濃度。
3. Western Blotting
3.1. 蛋白樣品準(zhǔn)備
每個(gè)樣品的上樣量為20 μg （具體樣品WB條件見下表格），加入對(duì)應(yīng)的5 X SDS （β-ME終濃度1%），用buffer補(bǔ)齊至10μl。95 ℃沸水浴中煮沸10 min。
3.2 SDS-PAGE膠制備 配置10%的分離膠和5%的濃縮膠，進(jìn)行蛋白樣品電泳。
3.3 電泳后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗免疫 （一個(gè)目的蛋白/GAPDH內(nèi)參），二抗免疫，顯色過(guò)。具體流程見流程圖。
4. 蛋白表達(dá)量定量分析
利用Image lab 對(duì)ECL化學(xué)發(fā)光顯色后結(jié)果，轉(zhuǎn)化成灰度圖后，對(duì)信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行相對(duì)定量分析。
